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X-Biotech產(chǎn)品常見(jiàn)問(wèn)題及回答

SDS-PAGE電泳：

1．蛋白Marker在凝膠上缺失部分條帶？

檢查使用的凝膠類型和百分比。根據(jù)蛋白分子量大小不同，使用不同孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。常用聚丙烯酰胺凝膠組分中雙丙烯酰胺和丙烯酰胺的物質(zhì)的量的比為1：29（或0.8:29.2），有效分離范圍如下表。

在Tris-Glycine膠中，通常12.5%的膠可以將10-180kDa的條帶有效分開，10%的膠10/15/17kDa的條帶會(huì)一起壓縮在*前沿，8%的膠10/17/25會(huì)一起壓縮在*前沿。

2.為什么你們的蛋白Marker跟其他品牌蛋白Marker條帶指示大小不一致？換用不同凝膠，條帶大小變化也不一樣？

SDS-PAGE中非預(yù)染蛋白marker受不同緩沖體系的影響小，而預(yù)染蛋白質(zhì)marker由于多肽鏈上連接的染料集團(tuán)受不同緩沖體系的影響比較大，因此預(yù)染蛋白marker在使用的不同緩沖體系中，需要用非預(yù)染蛋白marker進(jìn)行標(biāo)定。

各個(gè)品牌條帶指示大小不一致，可能有幾個(gè)因素：

（1）采用的標(biāo)定方式和標(biāo)示方法不一樣。

①標(biāo)定采用的非預(yù)染蛋白質(zhì)marker不一樣。分子量相同的蛋白由于氨基酸殘基序列組成不同，與SDS的結(jié)合有差異，從而顯示出不同的表觀分子量。

x-biotech標(biāo)定采用的非預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，采用廣泛通用的Biorad1610363（10-250kDa），Thermo26614（10-200kDa），26610（14.4-116kDa）和26632（3.4-100kDa）進(jìn)行標(biāo)定，并且標(biāo)示分子量與標(biāo)定實(shí)測(cè)表觀分子量非常接近。

②由于SDS-PAGE測(cè)量誤差比較大，需要多次和多平行樣測(cè)定。

（2）各個(gè)品牌預(yù)染蛋白marker標(biāo)記采用的染料不一樣，導(dǎo)致在不同緩沖體系中的表觀分子量變化不一樣，有時(shí)差距極大。比如，某品牌藍(lán)色條帶在TrisGlycine與Bis-Tris膠中比較，其表觀分子量變化均超過(guò)10%以上，有的條帶變化甚至超過(guò)20%以上。

經(jīng)測(cè)定，x-biotech預(yù)染蛋白質(zhì)的藍(lán)色和綠色條帶表觀分子量在不同的緩沖體膠中基本無(wú)變化（TrisGlycine，BisTris，Tris-acetate，Tricine）或變化極小（Hepes-Tris）；橙色條帶跟進(jìn)口品牌變化基本一致，在Bis-Tris，Tris-acetate和部分改良TrisGlycine預(yù)制膠中表觀分子量降低約10%?；究梢源娣穷A(yù)染marker。

3.在蛋白marker泳道中看到了一些額外的條帶。可以提供一些建議嗎？

（1）上樣時(shí)，請(qǐng)注意確保相鄰樣品泳道沒(méi)有交叉污染。蛋白質(zhì)上樣過(guò)多,可能會(huì)飄散到別的泳道，導(dǎo)致產(chǎn)生額外的條帶，這個(gè)問(wèn)題在使用銀染凝膠時(shí)尤為突出。

（2）Marker儲(chǔ)存不當(dāng)或反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，產(chǎn)生額外條帶。x-biotech預(yù)染蛋白marker基本沒(méi)有這種現(xiàn)象。

4. 您們的蛋白marker的推薦上樣體積是多少？

0.75mm和1.0mm建議3-5ul，1.5mm建議8-10ul。

5. 我可以將你們的預(yù)染蛋白marker用于非變性凝膠電泳嗎？

我們不建議將我們的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品用于非變性凝膠電泳。因?yàn)樗鼈円呀?jīng)變性（在 SDS 樣品緩沖液中）和預(yù)還原（通過(guò)專有方法），預(yù)染marker其標(biāo)示分子量不代表在非變性凝膠電泳中的樣品分子量，但是可以作為一個(gè)電泳相對(duì)標(biāo)尺。 

6. 為什么預(yù)染蛋白marker電泳條帶有時(shí)上面條帶寬下面窄，不是一樣的寬窄？

請(qǐng)檢查緩沖液的pH和更換pH標(biāo)準(zhǔn)品。   

7. X-biotech的預(yù)染Marker產(chǎn)品穩(wěn)定性如何？

x-biotech產(chǎn)品非常穩(wěn)定。通過(guò)我們的測(cè)試，x-biotech預(yù)染Marker25度放置35天幾乎無(wú)變化；37度放置28天僅130kDa以上大分子稍變?nèi)?，不影響使用?0度放置9天僅130kDa以上大分子稍變?nèi)?，不影響使用?0度對(duì)x-biotech小分子影響小，大分子逐漸變?nèi)?。大分子逐漸變?nèi)蹩赡苁歉邷厝芙庑圆豢赡孀冃?，?dǎo)致溶解性降低。

8.你們的預(yù)染蛋白marker是否不穩(wěn)定，啟用后條帶逐漸消失降解，*后只剩*前沿的很深的藍(lán)色條帶

x-biotech產(chǎn)品非常穩(wěn)定。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是由于實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)或其他原因，在預(yù)染蛋白marker中引入了某種外源物質(zhì)導(dǎo)致蛋白marker特異降解成小片段。解決方法：a注意實(shí)驗(yàn)操作習(xí)慣，使用干凈的一次性的取樣槍頭，b多人使用時(shí)，蛋白marker啟封后立即用干凈的離心管和槍頭分裝。

9.使用蛋白marker，條帶看起來(lái)彌散、模糊，怎么辦？

（1）配試劑盡可能使用超純水。

（2）選用合適濃度的凝膠并確認(rèn)凝膠在正常有效期內(nèi)。凝膠放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響分離效果，建議使用新配制的凝膠電泳。特別注意甲叉丙烯酰胺開封后多次稱取會(huì)很快失效。

（3）電壓過(guò)高或電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)熱過(guò)多導(dǎo)致電泳緩沖液溫度升高。建議參照產(chǎn)品使用說(shuō)明書。

（4）電泳緩沖液陳舊，pH值不在緩沖范圍內(nèi)。建議使用新鮮的電泳緩沖液，為了獲得理想的結(jié)果建議在使用前預(yù)冷緩沖液。

（5）存儲(chǔ)或取用不當(dāng)，引入外源污染，導(dǎo)致蛋白降解。建議使用干凈的槍頭和EP管分裝marker，用干凈的槍頭、緩沖液和電泳設(shè)備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（6）蛋白marker存儲(chǔ)太久并存儲(chǔ)不當(dāng)，或很多次取用。 x-biotech產(chǎn)品不存在這個(gè)問(wèn)題。

10.為什么有時(shí)候帶型不整齊，呈向上彎曲狀（“微笑狀”）或向下彎曲狀（“皺眉狀”）？

（1）“微笑狀”條帶可能是由于凝膠橫向溫度不均勻引起的，凝膠邊緣附近的間隔條起到了散熱器的作用?？烧{(diào)整實(shí)驗(yàn)溫度，如將電泳設(shè)備置于4°C環(huán)境中，向外槽加入更多的緩沖液以散熱，降低電泳功率，避免過(guò)熱，過(guò)熱能夠引起條帶扭曲，甚至?xí)?dǎo)致玻璃板碎裂。

（2）“皺眉狀”條帶可能是由于電的不連續(xù)導(dǎo)致的不均勻電場(chǎng)（如玻璃板底部有氣泡等）或凝膠厚度不一致引起的。凝膠邊緣不完全聚合也能導(dǎo)致“皺眉狀”條帶。因此，在電泳開始前需要確保凝膠中或凝膠底部沒(méi)有氣泡，并且凝膠已經(jīng)完全聚合。

（3）如果在凝膠兩側(cè)泳道，由于邊緣效應(yīng)、離子強(qiáng)度不均等原因，均會(huì)導(dǎo)致帶型變寬或彎曲。建議點(diǎn)樣時(shí)將蛋白marker放在泳道中間或者在邊緣點(diǎn)兩個(gè)泳道m(xù)arker。

（4）凝膠配制不勻，凝膠內(nèi)存有氣泡，或點(diǎn)樣孔中有細(xì)碎的殘膠。

（5）配膠過(guò)程中，分離膠和濃縮膠的界面不平。

（6）電泳槽存在封閉不嚴(yán)的情況，導(dǎo)致電壓不穩(wěn)，出現(xiàn)跑膠條帶傾斜。

（7）檢查試劑特別是甲叉丙烯酰胺是否失效

11.為什么x-biotech marker在某些使用上層膠染料的預(yù)制膠或預(yù)混液膠表現(xiàn)不佳，上樣量小的時(shí)候亮度不夠？

  上層膠不要加染料即可。上層膠染料可能對(duì)某些蛋白質(zhì)的電泳產(chǎn)生影響，比如等電點(diǎn)偏低的蛋白質(zhì)。

轉(zhuǎn)膜：

1.預(yù)染蛋白Marker電泳后清晰，但是轉(zhuǎn)膜后顏色變淡？

通常情況下，轉(zhuǎn)膜后x-biotech 預(yù)染marker條帶會(huì)更鮮亮，如果顏色變淡，可能有幾種情況：

（1）轉(zhuǎn)印不完全

  操作不當(dāng)，比如，轉(zhuǎn)膜沒(méi)有加冰袋，溫度過(guò)高；膠和濾紙沒(méi)夾緊。

  轉(zhuǎn)膜條件不適合，轉(zhuǎn)膜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能透膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間過(guò)短，蛋白可能殘留在膠內(nèi)。

  膜沒(méi)有充分活化，甲醇濃度太高易造成蛋白穿膜，轉(zhuǎn)移到濾紙上；未活化可能也可能導(dǎo)致膜吸附蛋白能力不強(qiáng)。

  膜孔徑不適合，建議小分子蛋白使用0.22um膜。

（2）轉(zhuǎn)印正常，可能使用了特殊的轉(zhuǎn)膜緩沖液，建議使用通用轉(zhuǎn)膜緩沖液，或品質(zhì)有保障的商用轉(zhuǎn)膜緩沖液如易優(yōu)快轉(zhuǎn)液。另外轉(zhuǎn)膜液均不需要加SDS，若實(shí)驗(yàn)必須使用，建議SDS濃度不要超過(guò)0.02–0.04%。

2.洗膜的過(guò)程中顏色變淺？

可能使用了比較特殊的緩沖液或者洗滌強(qiáng)度過(guò)強(qiáng)。建議使用通用緩沖液，或品質(zhì)有保障的商用緩沖液，適當(dāng)洗滌。較小孔徑的膜可以在封閉和洗滌過(guò)程中更好地保留蛋白質(zhì)。

3.為什么轉(zhuǎn)膜后NC/PVDF膜上蛋白標(biāo)品的條帶會(huì)丟失？

按標(biāo)準(zhǔn)操作流程，2.6-400kD都可正常轉(zhuǎn)膜成功。

4. 蛋白質(zhì)marker里小分子蛋白質(zhì)條帶穿膜。該如何解決這個(gè)問(wèn)題？

按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程，通常都可得到良好結(jié)果。如果出現(xiàn)蛋白條帶穿膜而過(guò)的情況，重點(diǎn)檢查以下幾個(gè)因素：

1） 轉(zhuǎn)印條件，建議適當(dāng)降低電壓、電流或縮短轉(zhuǎn)印時(shí)間。

2） 確保轉(zhuǎn)膜緩沖液的甲醇濃度和時(shí)長(zhǎng)合適，x-biotech低分子量預(yù)染蛋白marker不需要加甲醇。轉(zhuǎn)膜前使用濃度為10–20%的甲醇平衡PVDF膜，時(shí)間一般不超過(guò)30秒。

3） SDS濃度適當(dāng)。X-biotech小分子量和大分子marker轉(zhuǎn)膜時(shí)均不需要SDS，若實(shí)驗(yàn)必須使用，建議SDS濃度不要超過(guò)0.02–0.04%。過(guò)多的SDS會(huì)阻礙蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合。

4） 檢查膜的質(zhì)量、孔徑和靶標(biāo)蛋白質(zhì)的大小。如果您的目標(biāo)蛋白質(zhì)小于10 kDa，*好使用0.2μm及以下孔徑的膜。