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SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn)常見問題及回答

聚丙烯酰胺凝膠電泳已是一項(xiàng)成熟完善的技術(shù)，但實(shí)驗(yàn)中仍存在一些需要特別注意或者改進(jìn)的問題。實(shí)驗(yàn)中常遇到的問題及回答如下。

問題：與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相比，蛋白質(zhì)沒有遷移到期望的位置？

    ?由于氨基酸殘基組成和序列不同，結(jié)合SDS的量有差異，因此具有同樣理論分子量的蛋白質(zhì)其表觀分子量常常與理論值有出入，有時甚至偏差很大。

    ? 除了蛋白質(zhì)降解外，非人為的剪切或翻譯錯誤都能導(dǎo)致產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。重新檢查表達(dá)該蛋白質(zhì)的 DNA 序列中是否存在稀有密碼子、內(nèi)部起始密碼子或終止密碼子，或其他導(dǎo)致不完全翻譯的基因突變。

問題：蛋白質(zhì)條帶染色不佳，呈彌散狀，或者染色開始后條帶消失？

    ? 這種在染色和脫色過程中發(fā)生條帶彌散的現(xiàn)象，大多通常出現(xiàn)于小分子蛋白質(zhì)（低于 12kDa）實(shí)驗(yàn)。使用更快速的染色方法并盡量縮短各操作步驟之間的時間能夠改善條帶形狀。

    ? 非常小的蛋白質(zhì)（低于 4kDa）可能需要能與蛋白質(zhì)形成共價交聯(lián)的固定劑， 如甲醛或戊二醛。染色前，將凝膠放在用于銀染的固定液中，輕輕搖振， 室溫孵育至少 1h 或孵育過夜。用去離子水清洗 3 次，每次 30s,然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。當(dāng)然，從凝膠中能回收到的固定后的蛋白質(zhì)會大幅減少。

    ? 凝膠脫色時間太長，僅需重新染色即可。

    ? 蛋白質(zhì)加樣量不足?？捡R斯亮藍(lán)染色*低只能檢測到 0.lug 的蛋白質(zhì)條帶。如果考馬斯亮藍(lán)染色不夠靈敏，可以把凝膠沖洗后再進(jìn)行銀染。

問題：凝膠邊緣的染料前沿及條帶呈向上彎曲狀（“微笑狀”）或向下彎曲狀（“皺眉狀”）？

    ? “微笑狀”條帶可能是由于凝膠橫向溫度不均勻引起的，凝膠邊緣附近的間隔條起到了散熱器的作用。這個問題可以通過以下措施解決：使用主動控制溫度（如將電泳設(shè)備置于 4°C 環(huán)境中），向外槽加入更多的緩沖液以散熱，和/或降低電泳功率。過熱能夠引起條帶扭曲，甚至?xí)?dǎo)致玻璃板碎裂。

    ? “皺眉狀”條帶可能是由于電的不連續(xù)導(dǎo)致的不均勻電場（如玻璃板底部有氣泡等）或凝膠厚度不一致引起的。凝膠邊緣不完全聚合也能導(dǎo)致“皺眉狀”條帶。因此，在電泳開始前需要確保凝膠中或凝膠底部沒有氣泡， 并且凝膠已經(jīng)完全聚合。

問題：蛋白質(zhì)條帶分辨率不夠？

    ? 可能需要優(yōu)化丙烯酰胺單體濃度、雙丙烯酰胺濃度或電泳時間。一般而言， 高濃度的膠和更徹底的交聯(lián)能夠提高小蛋白質(zhì)的分辨率，大蛋白質(zhì)則反之。增加雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的量可減少基質(zhì)的孔徑大小，同時也會影響表 19-5 給出的丙烯酰胺總濃度參考值。延長電泳時間可提高較大蛋白質(zhì)的分離效 果。電泳過程中使用預(yù)染分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品有助于蛋白質(zhì)條帶的分離觀察。

    ? 在某些情況下，彼此接近的蛋白質(zhì)條帶可通過減少加樣量或降低蛋白濃度提高分辨率，這樣蛋白質(zhì)條帶會變得更細(xì)。

問題：蛋白質(zhì)條帶呈彌散狀、條紋狀或模糊不清？

    ? 配試劑盡可能使用超純水。

    ? 使用 Tris 堿制備緩沖液至關(guān)重要。如果緩沖液用 Tris-HCl 制備，離子強(qiáng)度高，導(dǎo)致積層膠壓膠效果差，從而出現(xiàn)彌散的條帶。

    ? 樣品中高濃度的鹽可以導(dǎo)致條帶失真。可通過透析、沉淀或脫鹽降低樣品的鹽濃度。

    ? 電壓可能太高。使用 8V/cm 電壓直到漠酚藍(lán)前沿穿過積層膠，然后提高到10-15V/cm。

    ? 聚集性物質(zhì)會積聚在膠孔中，并在電泳過程中慢慢溶解，從而產(chǎn)生條紋狀。

    ? 疏水性蛋白，如含有多個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，在煮沸時可能會發(fā)生聚集或寡聚化。為避免這個問題，可將這些樣品在45-55℃條件下溫浴10-60min 變性。對于其他的不溶性蛋白，可加入 4-8mol/L 尿素或增加 SDS 的濃度使其溶解。