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SDS-PAGE

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠是一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，可以根據(jù)蛋白質(zhì)和核酸分子的電荷、形狀和大小來(lái)分離。包括非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳（native-PAGE）和變性聚丙烯酰氨凝膠電泳（蛋白質(zhì)變性劑通常為SDS，核酸變性劑通常為尿素、甲酰胺等）。

SDS-PAGE，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis），是一種常用的根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小分離樣本中蛋白質(zhì)和多肽的技術(shù)。

SDS-PAGE電泳的蛋白質(zhì)遷移首先受SDS結(jié)合度的影響，其次還受緩沖體系，膠濃度，電壓和電泳時(shí)間等影響。

SDS-PAGE常用緩沖體系

Tris-Glycine體系：

經(jīng)典Laemmli Tris-Glycine體系，特別是其不連續(xù)體系，成熟經(jīng)典，條帶銳利，成本低，而且非常適合手工灌膠。10-300kDa都能獲得很好的分離效果。其缺點(diǎn)是堿性導(dǎo)致丙烯酰胺降解，保存期短。

商業(yè)預(yù)制Tris-Glycine膠為了延長(zhǎng)保存期大多做了改良優(yōu)化，導(dǎo)致性能較經(jīng)典Laemmli Tris-Glycine體系降低。

Tris-Acetate體系：適應(yīng)于大分子分離。通常250kDa以上建議使用Tris-Acetate體系。

Tricine體系：

為小分子多肽電泳分離發(fā)展的SDS-PAGE電泳體系，1-30kDa都能很好分離。通常15kDa以下建議使用Tricine體系。

 

Bis-Tris 體系

由于Tris-Glycine體系的保存效期短的缺陷，開(kāi)發(fā)了Bis-Tris和Hepes-Tris體系。相比于傳統(tǒng)Tris-Glycine體系膠，Bis-Tris凝膠中性略偏酸，有助于減少對(duì)蛋白質(zhì)修飾的影響，并帶來(lái)更清晰銳利的條帶，不容易降解，在4-25℃的條件下能夠長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。因此商品化膠大多采用Bis-Tris 體系。

Bis-Tris 體系需要做大量?jī)?yōu)化工作，因此各家預(yù)制膠廠家提供的Bis-Tris膠表現(xiàn)差異較大。另外在Bis-Tris膠不同蛋白表觀分子量變化比較大，成本也較高。

Bis-Tris Mops

Bis-Tris Mops分離的分子較大一些，可以分離15-250kDa的多肽分子。

Bis-Tris Mes

Bis-Tris Mes緩沖體系對(duì)較小分子效果較好，可以分離3.5-160kDa的多肽分子。

常用預(yù)制膠提供商（可咨詢(xún)）

常用緩沖體系提供商（可咨詢(xún)）

SDS蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)

SDS-PAGE影響因素

• 丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺

    聚丙烯酰胺凝膠主要是由丙烯酰胺（Acrylamide，Acr）和N，N'-亞甲雙丙烯酰胺（N,N'-Methylenebisacrylamide，Bis），在引發(fā)劑和增速劑存在時(shí)聚合成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

    通常在配制的聚丙烯酰胺凝膠中添加0.1%的SDS，避免與蛋白結(jié)合的SDS脫落而達(dá)不到充分結(jié)合，影響電泳效果。也有部分預(yù)制膠為了擴(kuò)展非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳應(yīng)用不添加SDS。

• Acr/Bis的比例和凝膠濃度與平均孔徑有關(guān)

  當(dāng)Bis的量占總凝膠濃度的5%時(shí)，平均孔徑*小因此通常采用0.8/29.2和1/29的比例

  ?

                                                         何忠效，張樹(shù)政，電泳，科學(xué)出版社，1999，p15

 許多廠商出售不含金屬離子雜質(zhì)的電泳級(jí)丙烯酰胺和N，N-亞甲雙丙烯酰胺。含29%（m/V）丙烯酰胺和1%（m/V）N，N'-亞甲雙丙烯酰胺的儲(chǔ)液應(yīng)以溫?zé)岬娜ルx子水（以促使雙丙烯酰胺溶解）配制。丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)緩慢轉(zhuǎn)化為丙烯酸和雙丙烯酸，這種脫氨反應(yīng)是由光和堿催化的，溶液pH值不超過(guò)7.0。該溶液應(yīng)置暗色瓶中室溫保存，每隔數(shù)月須重新配制。有些廠家會(huì)提供預(yù)混液。

N，N-亞甲雙丙烯酰胺多次開(kāi)瓶稱(chēng)取易失效，建議分裝為小包裝保存。

• TEMED  

TEMED是丙烯酰胺聚合形成的高分子，其作用是聚合反應(yīng)是自由基聚合，需要有引發(fā)劑產(chǎn)生自由基將反應(yīng)引發(fā)過(guò)硫酸銨就是引發(fā)劑，而TEMED可以催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基，從而加速丙烯酰胺凝膠的聚合。TEMED具有濃烈的刺激性氣味，使用時(shí)注意防護(hù)。

• 過(guò)硫酸銨APS
  

過(guò)硫酸銨在水溶液中能水解成硫酸氫銨和過(guò)氧化氫，為制備PAGE膠提供自由基。過(guò)硫酸銨易潮解失效，建議小瓶分裝。過(guò)硫酸銨打開(kāi)后建議一次性配成10%水溶液，分裝凍于-20度。

• 緩沖體系

     SDS-PAGE使用的*廣泛的是TriGlycine體系，通常適用于10-300kDa的蛋白質(zhì)分離，對(duì)于小分子的分離發(fā)展了Tricine體系，可以分離1-30kDa；對(duì)于大分子發(fā)展了用Tris-Acetate體系，可以分離大分子達(dá)到500kDa。但是由于TriGlycine體系保存期比較短，預(yù)制膠發(fā)展了Bis-Tris Mops體系和Bis-Tris Mes體系，以及Hepes-Tris體系。

• SDS

    SDS是一種陰離子表面活性劑，可和蛋白質(zhì)分子結(jié)合可形成密度相同的短棒狀復(fù)合物，并且使蛋白質(zhì)帶上大量?jī)糌?fù)電荷，掩蓋不同蛋白分子天然電荷差異（如圖1.1）。蛋白樣品與SDS充分結(jié)合后，可屏蔽蛋白結(jié)構(gòu)和本身電荷的影響，基本只按照蛋白分子量大小分離。關(guān)于SDS的使用可以追溯到1964年，一名MIT的學(xué)生在分離大腸桿菌信封蛋白(envelope protein)時(shí)，發(fā)現(xiàn)SDS可使蛋白解聚并讓蛋白在合適的緩沖體系里電泳，增強(qiáng)蛋白分離效果^[1]。隨著SDS-PAGE技術(shù)的發(fā)展，SDS-PAGE檢測(cè)范圍可達(dá)到2kDa-500kDa^[2,3,4,5]。

    SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量受SDS單體濃度影響而不是總濃度：

        1.當(dāng)SDS單體濃度大于1mM時(shí)，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS達(dá)到充分結(jié)合，其結(jié)合重量比為1:1.4（此時(shí)平均約1.87個(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子，不同氨基酸殘基序列結(jié)合SDS的量有差異），如果降低到0.5mM，結(jié)合重量比只有1:0.4。為了保證充分結(jié)合，通常蛋白質(zhì)與SDS的重量比應(yīng)為1:3-4

        2.保證多肽鏈二硫鍵充分還原達(dá)到充分結(jié)合（樣品緩沖液beta巰基乙醇4-5%，DTT2-3%）。

        3.只有在低離子強(qiáng)度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度，因此樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低，一般為10-100mM。

         4.SDS的產(chǎn)品質(zhì)量：許多廠商售有特級(jí)SDS，其純度足以滿足電泳需要。理論上任何一種產(chǎn)品都能獲得可重復(fù)的結(jié)果，但若用一個(gè)廠家的SDS代替另一種SDS，多肽遷移的譜圖變化甚大，故建議專(zhuān)門(mén)使用同一個(gè)品牌的 SDS。若分離的蛋白質(zhì)需要從膠上洗脫下來(lái)測(cè)序。應(yīng)按Hunkapiller等(1983)提供的方法進(jìn)一步純化電泳級(jí)的SDS。

參考文獻(xiàn)：

1、Pederson T. Turning a PAGE: the overnight sensation of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. FASEB J. 2008 Apr;22(4):949-53. doi: 10.1096/fj.08-0402ufm. Erratum in: FASEB J. 2019 May;33(5):6682. PMID: 18378803.

2、Matsumoto H, Haniu H, Komori N. Determination of Protein Molecular Weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 2019;1855:101-105. doi: 10.1007/978-1-4939-8793-1_10. PMID: 30426411.

3、Sch?gger H. Tricine-SDS-PAGE[J]. Nature Protocol, 2006, 1(1):16-22.

4、Monica CR, Fabiola AP, et al. Tris-Acetate Polyacrylamide Gradient Gels for the Simultaneous Electrophoretic Analysis of Proteins of Very High and Low Molecular Mass. Methods in molecular biology. 2019, 1855: 269-277.

5、Bolt MW, Mahoney PA. High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 1997 May 1;247(2):185-92. doi: 10.1006/abio.1997.2061. PMID: 9177676.

6、Omstein L.Arinals N.Acad.Sci，1964(121)：321

7、M.R.格林，J.薩姆布魯克. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第四版），第十九章，方案8 蛋白質(zhì)的SDS-PAGE.