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蛋白電泳基礎(chǔ)知識

蛋白質(zhì)和多肽

    生物體蛋白質(zhì)和多肽通常是由20種L-氨基酸的α-氨基和α-羧基縮合而成的線性連接的生物大分子，是生命活動的主要承擔(dān)者。通常少于40個氨基酸殘基組成的被稱為多肽。要發(fā)揮生物學(xué)功能，蛋白質(zhì)需要正確折疊為一個特定構(gòu)型，40-50個氨基酸殘基通常是一個功能性結(jié)構(gòu)域大小的下限。肽鏈依靠氨基酸間殘基的氫鍵、疏水相互作用、范德華力、二硫鍵及部分金屬鍵等進(jìn)一步折疊形成高級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分為四級，一級結(jié)構(gòu)就是蛋白質(zhì)多肽鏈上從N端到C端氨基酸殘基的組成序列；二級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，包括α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等；三級結(jié)構(gòu)是指由序列上相隔較遠(yuǎn)的氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用，而具有范圍廣泛的卷曲與折疊；四級結(jié)構(gòu)是指部分由兩條或多條具有三級結(jié)構(gòu)的多肽(蛋白亞基)組成的蛋白質(zhì)，通過非共價鍵結(jié)合成一個功能蛋白質(zhì)。

    真核生物蛋白質(zhì)生物合成后通常還會進(jìn)一步進(jìn)行修飾，修飾通常包括磷酸化，N，O糖基化等等，修飾作用對蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮具有重要作用。

20種氨基酸圖

氨基酸密碼子表及人和中國倉鼠卵細(xì)胞中氨基酸密碼子使用頻率

蛋白質(zhì)分子量                          

    蛋白質(zhì)分子量是組成蛋白質(zhì)分子的所有原子的原子量總和。蛋白質(zhì)分子除組成肽鏈的氨基酸殘基分子量外，還包括修飾物分子量。由于蛋白質(zhì)修飾的存在，通常真核表達(dá)蛋白質(zhì)是由不同修飾程度的蛋白質(zhì)組成的混合物。通常天然蛋白質(zhì)氨基酸殘基的平均分子量大約在110左右，通過氨基酸殘基數(shù)量可以大致估計未修飾蛋白質(zhì)多肽的分子量。

    蛋白質(zhì)分子量實驗測定

    1.可通過質(zhì)譜準(zhǔn)確測定

    2.通過SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)表觀分子量

    聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）根據(jù)蛋白質(zhì)分子的電荷、形狀和大小來分離的。蛋白質(zhì)結(jié)合大量SDS后可以屏蔽蛋白質(zhì)本身電荷的影響，形成棒狀結(jié)構(gòu)，SDS-PAGE遷移距離基本只與肽鏈長度相關(guān)，因此通過蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)可以測定蛋白質(zhì)的表觀分子量。

    在SDS-PAGE中蛋白質(zhì)凝膠遷移距離與蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)（指數(shù)或冪）線性相關(guān)。由于氨基酸殘基組成和序列不同，結(jié)合SDS的量有差異，因此具有同樣計算分子量蛋白質(zhì)，SDS-PAGE的表觀分子量常常距理論值偏大或偏小，有時甚至很大。

    蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)

    SDS-PAGE電泳圖譜表觀分子量計算

• 確定測量基線，對不連續(xù)膠從分離膠界面開始，對梯度膠從加樣孔底部開始

• 測量電泳條帶的溶劑前沿相對于基線的距離 

• 測量電泳條帶的上沿相對于基線的距離，計算相對遷移率

• 以蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的分子量和遷移距離，或相對遷移率做回歸曲線。線性擬合蛋白質(zhì)分子量與遷移距離通常40kDa以上成冪曲線，20-100kDa成對數(shù)曲線，30kDa以下成指數(shù)曲線。

• 根據(jù)蛋白樣品遷移距離，或相對遷移率，通過蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和遷移距離的回歸方程計算表觀分子量。

蛋白質(zhì)濃度測定

    蛋白質(zhì)濃度測定通常采用如下方法：

    紫外（UV）吸收法：單一純凈蛋白質(zhì)可以通過蛋白質(zhì)的A280特征摩爾消光系數(shù)定量。

    化學(xué)法：各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16%，可以通過凱氏定氮法準(zhǔn)確定量。

    比色法：早期：雙縮脲法，F(xiàn)olin-酚試劑法（Lowery法）。目前更多使用BCA法，考馬斯亮藍(lán)法（Bradford），更微量。

    實驗過程中，*常用的方法有BCA法、UV法以及SDS-PAGE半定量法。

    BCA法：BCA方法是近年來廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)定量方法。其原理是，在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與二價銅離子絡(luò)合并將二價銅離子還原為一價銅離子。BCA與一價銅離子結(jié)合形成穩(wěn)定的藍(lán)紫色復(fù)合物。該復(fù)合物在562 nm處有較高的吸光值，并與蛋白質(zhì)濃度呈正比。

    SDS-PAGE法：可以確定蛋白質(zhì)純度，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)顏色深度可半定量

蛋白質(zhì)電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）可根據(jù)蛋白質(zhì)分子的電荷、形狀和大小來分離蛋白。

    電泳技術(shù)發(fā)展史

    蛋白質(zhì)電泳歷史可以追溯到1809年，詳見下圖：

   SDS-PAGE

      SDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis)是測定蛋白質(zhì)亞基分子量的*佳選擇之一。

      蛋白質(zhì)結(jié)合大量SDS后可以屏蔽蛋白質(zhì)本身電荷的影響，形成棒狀結(jié)構(gòu)排除形狀的影響，遷移距離基本只與肽鏈長度相關(guān)，因此通過蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)可以測定蛋白質(zhì)的表觀分子量。

      在SDS-PAGE中蛋白質(zhì)凝膠遷移距離與蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)（指數(shù)或冪）線性相關(guān)。由于蛋白質(zhì)和多肽氨基酸殘基組成不同，影響結(jié)合SDS的量，因此同樣的計算分子量，其表觀分子量常常距理論值偏大或偏小，有時甚至很大。

      SDS-PAGE簡單經(jīng)濟(jì)快速高效。15-100k可以有效分辨分子量差異10%的蛋白質(zhì)（分辨率可以分辨大小差3%的多肽）。隨著SDS-PAGE技術(shù)的發(fā)展，SDS-PAGE檢測范圍可達(dá)到2kD-500kD。