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蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)

蛋白質(zhì)由于氨基酸序列和卷曲折疊的高級結(jié)構(gòu)的不同表現(xiàn)為不同的形狀大小和等電點(diǎn)，真核生物表達(dá)蛋白質(zhì)還有各種修飾如磷酸化、糖基化的影響。因此蛋白質(zhì)的分子量標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)應(yīng)用的不同分為：天然蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，SDS-PAGE蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。

天然蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)

    通常包括雞溶菌酶，雞卵清白蛋白，牛血清白蛋白等，有的蛋白質(zhì)由多個亞基組成，用于分子篩層析和非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳等。

SDS-PAGE蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)：

  聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是根據(jù)蛋白質(zhì)分子的電荷、形狀和大小來分離的。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)合大量SDS后（多肽鏈結(jié)合SDS達(dá)到飽和結(jié)合時，結(jié)合重量比為1:1.4，平均每1.87個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子），可以屏蔽蛋白質(zhì)本身電荷的影響，并形成棒狀結(jié)構(gòu)。因此SDS-PAGE蛋白質(zhì)遷移距離基本只與肽鏈長度相關(guān)，通過蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)可以測定蛋白質(zhì)表觀分子量。

      SDS-PAGE蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)由單肽鏈蛋白質(zhì)組成，包括非預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，Western Blot蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。

                         附圖為10%凝膠，pH7.2 SDS-磷酸鹽緩沖系統(tǒng)

SDS非預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)

  由于蛋白質(zhì)和多肽鏈的氨基酸殘基組成和序列不同，結(jié)合SDS的量有差異，因此具有同樣理論分子量的蛋白質(zhì)其表觀分子量常常與理論值有出入，有時甚至偏差很大。在不同緩沖體系中，不同蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)條帶也會因?yàn)閭?cè)鏈基團(tuán)的組成序列不同而有一些遷移率的變化。因此選用一些特定的常用天然蛋白質(zhì)組合成為非預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。

           常用SDS-PAGE蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的天然蛋白質(zhì)

       經(jīng)典采用的天然蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（分子量單位：kDa)是：14.4（雞卵清溶菌酶），20.1（大豆胰蛋白酶抑制劑），31.0（碳酸酐酶），45.0（雞卵清白蛋白），66.2（牛血清白蛋白），有的根據(jù)實(shí)際需求增加條帶，如：97.4（磷酸化酶B）。

      Thermo公司提供天然蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（貨號：26610，單位：kDa）：14.4（雞卵清溶菌酶），18.4（牛奶β-乳球蛋白），25.0（限制性內(nèi)切酶 Bsp98I），35.0（豬肌乳糖脫氫酶），45.0（雞卵清白蛋白），66.2（牛血清白蛋白），116.0（大腸桿菌β半乳糖苷酶）。

       根據(jù)這些天然蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，各公司提供重組表達(dá)分布均一的（非預(yù)染）蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品（protein ladder），主要的有Biorad1610363（10-250kDa；10,15,20,25,37,50,75,100,150,250），Thermo26614（10-200kDa；10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 85, 100, 120, 150, 200），Thermo26632（3.4-100kDa；3.4,5,10,15,20,25,30,100）。

        X-biotech非預(yù)染蛋白質(zhì)ladder：

  范圍從2-450kDa，均是通過大腸桿菌重組表達(dá)，均一組成的重組多肽。即用型，不需要煮沸和還原，保存簡便，穩(wěn)定。生產(chǎn)中，即將提供。

SDS預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)

  非預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品需要染色后才可見，特別是天然蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)需要煮沸和還原，操作不方便，因此發(fā)展了預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品。預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品在多肽的某些氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)共價連接染料基團(tuán)，這樣不僅可以監(jiān)控電泳過程和電泳質(zhì)量，而且可通過條帶色彩直觀估計蛋白分子量大小及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜效果，因此得到了廣泛應(yīng)用。

  預(yù)染蛋白質(zhì)表觀分子量會由于染料基團(tuán)的影響，表現(xiàn)與原有蛋白質(zhì)和多肽不同的表觀分子量，而且在不同的緩沖體系中表現(xiàn)出不同的表觀分子量。因此在使用不同的緩沖液系統(tǒng)電泳時，預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品表觀分子量，需要使用非預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)定。

      X-biotech預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)

  采用均一序列組成的大腸桿菌重組蛋白質(zhì)通過均一定點(diǎn)標(biāo)記而成，具有如下突出優(yōu)點(diǎn)：

  1.條帶組成均一好，不會因?yàn)榫彌_體系不同的原因造成條帶相對位置的變動。

  2.分子量經(jīng)Biorad1610363，Thermo26614, Thermo26632非預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確標(biāo)定。藍(lán)色和綠色條帶表觀分子量在不同緩沖體系基本沒有變化（如：Tris-Glycine，Bis-Tris，Tris-Acetate，Tricine）或者變化極小（Hepes-Tris），可以替代非預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品使用。橙（紅）色條帶在Bis-Tris，Tris-Acetate，Hepes-Tris預(yù)制膠（和部分改良的Tris-Glycine預(yù)制膠）中，表觀分子量較標(biāo)示分子量小10%，變化跟進(jìn)口品牌變化基本一致。

  3.覆蓋1.5-400kDa全范圍，條帶數(shù)量多且分布均衡。

  4.產(chǎn)品極其穩(wěn)定。經(jīng)過測試，X-biotech預(yù)染marker（10-180kDa）25℃放置35天帶型幾乎無變化；37℃放置28天僅180kDa大分子條帶稍變?nèi)?，不影響使用?0℃放置9天僅180kDa大分子稍變?nèi)?，不影響使用?0℃對X-biotech小分子條帶影響小，大分子逐漸變?nèi)?。大分子條帶逐漸變?nèi)蹩赡苁歉邷貙?dǎo)致蛋白不可逆變性，溶解度降低。

  5.條帶不易脫色，色彩鮮亮，適應(yīng)廣泛使用的各種緩沖體系。

SDS Western Blot蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)

  Western Blot蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)：其多肽鏈帶有抗體結(jié)合基團(tuán)，可以與待測蛋白樣品一起轉(zhuǎn)膜和顯色。

  X-biotech Western Blot蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)

  從10kDa-300kDa，包含多個貨號，產(chǎn)品正在生產(chǎn)中。

SDS 熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)

  熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn): 蛋白肽鏈包含熒光標(biāo)記信號，可通過檢測熒光信號識別蛋白條帶。

  X-biotech 熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)中。

根據(jù)電泳圖譜計算表觀分子量         

     （1）確定測量基線，不連續(xù)膠從分離膠界面開始計算，梯度膠從加樣孔底部開始計算。     

     （2）測量電泳條帶的溶劑前沿相對于基線的距離，測量電泳條帶的上沿相對于基線的距離，計算相對遷移率。

     （3）以蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的分子量和遷移距離或相對遷移率做回歸曲線。線性擬合蛋白質(zhì)分子量與遷移距離通常40kDa以上成冪曲線，20-100kDa成對數(shù)曲線，30kDa以下成指數(shù)曲線。

     （4）根據(jù)蛋白樣品遷移距離或相對遷移率通過回歸方程計算目標(biāo)蛋白表觀分子量。