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Western Blot常見問題及建議

Western Blot是非常經典的分子生物學實驗，迄今已有419142篇（pubmed，2022）文獻發(fā)表。若想得到高質量條帶，實驗中有很多內容值得探討優(yōu)化。在分析問題之前，先明確兩個概念：蛋白（免疫）印跡和Western Blot。兩者時常通用。嚴格區(qū)分，蛋白（免疫）印跡，是指將蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠轉移到PVDF或硝基纖維素膜上，然后對蛋白質進行免疫檢測（1979，Towbin. etal）。Western Blot（WB）包含印跡前蛋白樣本制備和凝膠電泳分離步驟（1981，Burnette.etal）。 

注意：良好的實驗操作習慣是實驗成功與否的關鍵。在蛋白實驗過程中，應注意保持實驗環(huán)境和用具干凈，盡量低溫，以防降解。

1、WB結果中無信號或顯示信號弱?

(1) 檢測樣本不表達目的蛋白，建議選擇表達量高的組織或細胞作為陽性對照。

(2) 檢測樣本低表達目的蛋白，可提高上樣量。

(3) 樣本裂解不充分，如：核蛋白，建議使用強裂解液，充分釋放核蛋白。

(4) 蛋白被降解，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑，操作過程中注意保持干凈，避免引入蛋白酶，樣本避免反復凍融。

(5) 電泳時上樣量不足，在上樣前可用UV、BCA等方法測定濃度?？偟鞍咨蠘恿縹20ug。

(6) 膜選擇不當，導致轉膜不完全或者透膜。20kD以下可選用0.22uM PVDF膜，＞20kD可選用0.45uM。

(7) 轉印不完全或過轉印，可觀察蛋白marker轉印情況，并用麗春紅染膜確定條帶是否轉至膜上或轉過；適當調整轉膜的時間和電流。

(8) 抗體不能識別測試種屬的相關蛋白，購買抗體前應當認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠識別測試種屬的對應蛋白。

(9) 一抗孵育時間不足或者濃度不夠，建議提高抗體濃度或4℃結合過夜。

(10) 二抗與一抗不匹配，選擇針對一抗來源的種屬的抗體。

(11) 洗膜過度。洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。

2、WB結果中雜帶較多?

(1) 目的蛋白有多個修飾位點（如：磷酸化位點、糖基化位點、乙?；稽c等），本身可以呈現多條帶。建議查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。

(2) 目的蛋白有其它剪切本。查閱文獻或生物信息學分析可能性。

(3) 樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解。加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作。

(4) 上樣量過高或上樣過程中泳道蛋白污染。適當減少上樣量。

(5) 一抗特異性不高。重新選擇或制備高特異性的抗體。

(6) 一抗不純。純化抗體或者重新采購抗體。

(7) 一抗或者二抗?jié)舛绕?。降低抗體濃度。

3、WB結果中背景較高?

(1) 膜封閉不夠。延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液。

(2) 一抗稀釋度不適宜。增大稀釋倍數或者對抗體進行滴度測試，選擇*適宜的抗體稀釋度。

(3) 一抗孵育的溫度偏高。建議4℃結合過夜。

(4) 膜在實驗過程中干過。實驗過程中要注意保持膜的濕潤。

(5) 檢測時曝光時間過長。減少曝光時間。

(6) 不小心接觸到膜面。建議使用鑷子夾膜角，避開蛋白。

4、WB結果中條帶變形或彌散？

(1) 蛋白上樣量過高，條帶可能分辨率低、有縱向條紋且不直。

(2) DNA污染，樣品太黏稠，條帶可能過于狹窄扭曲。上樣前先去除基因組DNA。

(3) 鹽離子濃度（NaCl）、去垢劑濃度、RIPA緩沖液濃度過高，可能引起泳道寬度不一致，泳道變寬。可通過透析、沉淀或脫鹽降低樣品的鹽濃度。

(4) 裂解液或樣品緩沖液中還原劑過多，可能導致泳道邊緣有陰影。SDS-PAGE中，還原劑 DTT或 TCEP終濃度應小于50 mM，β-巰基乙醇終濃度應小于 2.5％。

(5) 凝膠放置時間過長，尤其偏堿性凝膠，聚丙烯酰胺可能慢慢水解成聚丙烯酸。

(6) 過量硫酸銨可能導致啞鈴型條帶，或泳道變寬。

(7) 凝膠不均勻或玻璃底板有氣泡，可能導致皺眉型條帶。

(8) 電壓太高，凝膠過熱會使條帶扭曲或邊緣呈微笑型。使用 8V/cm 電壓直到溴酚藍前沿穿過積濃縮膠，然后提高到10-15V/cm。增加預冷緩沖液或在冰浴環(huán)境電泳。

5、其它現象可能原因及建議：

(1) 膜上多處出現黑點或黑斑?？贵w與封閉試劑發(fā)生非特異性結合。

(2) 反白（條帶顯白色）。目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕摺?/span>

(3) 蛋白分子量偏低或偏高。膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。濃縮膠濃度均為 5%。分離膠的選擇：蛋白分子量很小時，推薦使用10-12%，例如蛋白分子量為 21kD 和 34kD ，選取的膠濃度為10%；分子量80kD，選10%；分子量180kD，選6%。